科研产出
大肠杆菌多酚氧化酶的分子克隆及异源高效表达
《中国饲料 》 2024 北大核心
摘要：菜籽粕、棉籽粕等非粮饲料资源存在的酚类化合物芥子碱、棉酚等抗营养因子，严重影响了其饲喂价值。本课题组筛选出的一株大肠杆菌属芥子碱降解菌SDB2已被证实能通过分泌多酚氧化酶来降解芥子碱和棉酚，本试验旨在运用基因工程技术克隆SDB2多酚氧化酶基因，实现其高效表达，为SDB2多酚氧化酶在饲料工业上的规模化应用奠定基础。从大肠杆菌SDB2中克隆出多酚氧化酶基因，将其与质粒pET28a连接后转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中培养，通过PCR鉴定及质粒酶切验证方法构建重组菌株，同时对重组克隆基因进行生物信息学分析。采用“2×2”交叉试验设计，以温度和诱导剂IPTG浓度两个影响因素诱导SDB2多酚氧化酶基因在重组菌株中高效表达，经SDS-PAGE和WB双重验证后，确立最佳诱导条件，最终纯化出目标酶蛋白。结果表明：（1）成功克隆SDB2多酚氧化酶基因，构建出异源表达重组菌株。（2）克隆出的SDB2重组多酚氧化酶基因含目标核苷酸741个，总编码氨基酸263个（含标签氨基酸20个），氨基酸组成的蛋白相对分子质量为28499.0，理论等电点为6.94，据此预测出SDB2重组多酚氧化酶三维结构模型。（3）确立SDB2多酚氧化酶异源高效表达的最佳诱导条件为温度37℃，IPTG浓度1 mmol，该条件下表达出大量可溶性酶蛋白，有利于工业化生产。本试验条件下，大肠杆菌SDB2多酚氧化酶成功实现了分子克隆及异源高效表达，为我国非粮饲料资源实现高效利用提供了技术参考。
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大恒799肉鸡Myoz1基因CDs区克隆、序列分析及其组织表达研究
《中国家禽 》 2024 北大核心
摘要：为研究钙调神经磷酸酶肌小结结合蛋白1(Myoz1)的氨基酸序列特征及其在不同组织器官中的mRNA表达水平，试验通过PCR克隆Myoz1 CDs序列，分别利用ExPASYProtparam、ProtScale、Target P、DNAStar Protean、SWISS-MODEL、SignalP 4.1 Server、NetPhos2.0Server和STRTNG软件，进行Myoz1蛋白理化特性、亲/疏水性、亚细胞结构、蛋白二级结构、三级结构、信号肽、磷酸化位点和蛋白互作分析，并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Myoz1基因表达量。结果显示：大恒799肉鸡Myoz1基因CDs序列全长为881 bp，可编码293个氨基酸；大恒799肉鸡Myoz1基因氨基酸序列与雉鸡、岩雷鸟位于一个分支，同源性最高，均高于96%，亲缘关系最近；Myoz1蛋白为水溶性蛋白且大多分布于细胞核内，分子式为C1442H2244N400O430S10，分子质量约为32 384.70 ku，理论等电点为9.12;Myoz1蛋白不存在信号肽，为分泌蛋白，共存在37个潜在的磷酸化位点、1个N-糖基化潜在位点；Myoz1蛋白二级结构主要由α-螺旋、β-转角和无规则卷曲组成，三级结构预测结果与其一致；Myoz1蛋白与ACTN2、LDB3、LMOD3等Z盘蛋白（PDZ-LIM结构域蛋白，ZASP）以及肌肉生长发育相关蛋白有相互作用的关系；Myoz1在1日龄大恒799肉鸡胸肌和腿肌的表达量显著高于其他组织，且在胸肌中的表达量高于腿肌（P<0.05）。研究表明Myoz1基因可能在肌肉生长发育过程中发挥调控作用。
关键词： 大恒肉鸡 Myoz1基因 克隆 生物信息学分析 组织表达
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芦笋胆固醇C-22羟化酶基因AoCYP90B27的克隆及表达模式分析
《西北农业学报 》 2023 北大核心 CSCD
摘要：为研究芦笋(Asparagus officinalis L.)甾体皂苷合成中下游胆固醇 C-22 羟化酶基因,首先通过基因组家族结合芦笋的转录组分析,筛选、预测到 1 个胆固醇 C-22 羟化酶基因 AoCYP90B27,通过 qRT-PCR进行组织表达模式分析,利用 plantCARE数据库进行启动子顺式作用元件预测分析及该基因在脱落酸、水杨酸及茉莉酸甲酯等激素及干旱胁迫中的表达情况分析.结果表明,AoCYP90B27 基因的cDNA全长为 1 443 bp,编码含有 481 个氨基酸残基,启动子区域除含有 TATA-box等保守元件,还存在与非生物胁迫和激素诱导响应的作用元件.该基因在不同组织器官中均有表达,根中的表达量显著高于地上部组织.在干旱胁迫、脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯诱导处理及其不同处理时间其基因的表达量明显不同,推测该基因在皂苷合成的下游途径中能催化胆固醇C-22 羟基化,形成多样的皂苷元参与多年生芦笋根系的逆境胁迫应答,为阐明皂苷合成的分子机制奠定了实验基础.
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水稻B-box锌指蛋白基因OsBBX26的 克隆及表达分析
《南方农业学报 》 2020 北大核心 CSCD
摘要：[目的]克隆水稻B-box锌指蛋白基因(OsBBX26),并分析其在非生物胁迫下的表达模式,为探究水稻B-box蛋白的非生物胁迫响应机制提供理论依据.[方法]以水稻模式品种日本晴为材料,采用RT-PCR克隆OsBBX26基因,对其进行生物信息学分析,并通过构建pBA-OsBBX26-YFP植物表达载体进行亚细胞定位.同时,采用实时荧光定量PCR检测分析OsBBX26基因的组织特异性及非生物胁迫(干旱、ABA、低温和高盐)下的表达模式.[结果]克隆获得的OsBBX26基因(LOC_Os08g42440)cDNA全长序列为1467 bp,编码488个氨基酸,其编码蛋白分子量为51.86 kD,理论等电点(pI)为6.63,包含1个B-box锌指结构域和1个CCT结构域,其中B-box结构域位于第13~60位氨基酸,CCT结构域位于第435~478位氨基酸,该蛋白定位于细胞核中.OsBBX26基因位于8号染色体上,启动子区域除了含有TATA-Box和CAAT-Box等基本转录元件外,还含有与逆境相关的顺式作用元件,包括低温响应元件LTR、脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element、厌氧响应元件ARE、茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif,以及MYB转录因子结合位点.OsBBX26蛋白与粳稻B-box蛋白亲缘关系最近,其次与籼稻B-box蛋白亲缘关系较近,与其他植物B-box蛋白也存在较高的相似性,其中与小米、大麦、高粱、玉米和短柄草B-box蛋白的氨基酸序列相似性分别达72%、72%、71%、69%和68%.OsBBX26基因在幼叶中的表达量最高,其次是在成熟叶片中,在幼根、成熟根、茎和幼穗中的表达量均极低,表明该基因表达具有明显的组织表达特异性.干旱、高盐、ABA和低温胁迫处理下OsBBX26基因均上调表达,干旱、高盐和ABA胁迫处理12 h达峰值,但低温胁迫处理在24 h后才达峰值.[结论]OsBBX26基因受干旱、高盐、ABA和低温胁迫诱导均上调表达,推测其参与水稻植株响应多种非生物胁迫,在逆境响应中发挥重要调控作用.
关键词： 水稻 B-box蛋白 克隆 非生物胁迫 表达分析 组织表达
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乌桕硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶基因的克隆及表达
《西南农业学报 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶是植物脂肪酸合成代谢的关键酶,直接调节膜脂和贮脂中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例。本研究通过RT-PCR及RACE技术,克隆乌桕硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶(SsSAD)的cDNA全长序列。结果显示,该序列包含1个1191 bp的完整的开放阅读框(GenBank登录号为EF079655),编码396个氨基酸,含33个氨基酸的叶绿体转移肽。其成熟肽含有363个氨基酸,推测其分子量为41.5 kDa,等电点为5.42。同源性分析及同源建模数据显示SsSAD和其它物种的SAD有较高的同源性,含有1个保守结构域。构建原核表达载体pMAL-SsSAD,转入大肠杆菌DH5α,并对诱导表达条件进行优化。
关键词： 乌桕 硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶 克隆 生物信息学分析 原核表达
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乌桕Cu/Zn超氧化物歧化酶基因克隆及耐盐性
《四川师范大学学报(自然科学版) 》 2016 北大核心
摘要：利用RT-PCR和RACE技术,成功获得了乌桕Cu/Zn超氧化物歧化酶(SsCu/Zn SOD)的cDNA全长.该序列含有486 bp的完整开放阅读框(Gen Bank登录号为KX169161),编码161个氨基酸残基,推测其相对分子质量为16.304 k Da,等电点为6.57.对应开放阅读框的基因组序列含有7个外显子和6个内含子.同源性及保守结构域分析显示SsCu/Zn SOD和其他物种的Cu/Zn SOD有较高的同源性(67.26%~88.69%),含有一个保守的活性区.构建原核表达载体p ET32-SsCu/Zn SOD在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,诱导出目的蛋白.转化菌的盐胁迫实验显示,其具有抗盐胁迫的功能.
关键词： SsCu/Zn超氧化物歧化酶基因 克隆 原核表达 盐胁迫
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苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1A的克隆及生物信息学分析
《西南农业学报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：以分离的3株苏云金芽孢杆菌质粒为模板,通过设计一对特异引物,PCR扩增得到3条全长3.6 kb的基因序列,其各自都包含一个完整的开放阅读框,编码序列全长分别是3468、3450、2697 bp(Genebank登录号分别为GQ385073,GQ385074,GQ385075);它们与cry1A类基因同源性都高达95%以上;分别编码1159、1150和902个氨基酸。并在此基础上采用生物信息学方法对这3个基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、跨膜结构域以及功能域等方面进行了预测和分析。为转基因抗虫植物和微生物杀虫工程菌的构建提供了基因来源。
冷相关转录因子CBF2基因的克隆及其植物表达载体的构建
《西南农业学报 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：从拟南芥Columbia基因组DNA中分别克隆了CBF2基因和低温诱导型启动子Rd29A。测序结果显示:克隆的CBF2基因长725 bp,编码216个氨基酸,与GeneBank公布的的序列相比对,核苷酸同源性为99.8%;启动子Rd29A全长为956 bp,与已报道的该启动子序列比较,其核苷酸同源性为99.5%。以双元载体pCAMBIA1301为基础,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF2,为利用CBF2基因提高植物的耐寒性创造了条件。
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CBF3基因的克隆、生物信息学分析及植物表达载体的构建
《湖南农业科学 》 2009 CSCD
摘要：从拟南芥基因组DNA中分别克隆了CBF3基因和逆境诱导型启动子Rd29A,测序结果显示:克隆的CBF3基因长776bp,编码216个氨基酸,与GeneBank公布的的序列相比对,核苷酸同源性达到99.2%,并利用生物信息学手段对其氨基酸序列、进化树、理化性质、疏水性/亲水性等进行分析;启动子Rd29A全长为956 bp,与已报道的该启动子序列比较,其核苷酸同源性为99.5%。以双元载体pCAMBIA1301为基础,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3,为利用CBF2基因提高植物的耐寒性创造了条件。
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拟南芥冷诱导CBF/DREB类结合因子的克隆及其生物信息学分析
《生物技术通报 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：CBF/DREB结合因子广泛存在于植物中,主要参与诸如干旱、高盐以及冷胁迫等相关基因的表达调控。以拟南芥DNA为模板,PCR扩增出3个冷诱导的CBF/DREB结合因子,即CBF1、CBF2及CBF3,利用生物信息学手段对三者的cDNA序列、氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性/亲水性、功能域、进化树、二级结构及DNA保守域的三级结构等进行了较为全面的分析。结果显示,CBF1、CBF2和CBF3的氨基酸序列同源性很高,达到91.4%,且都属于亲水性蛋白,三者在理化性质以及蛋白质二级结构乃至三级结构上也极为相似。另外,CBF1和CBF2都不具跨膜结构,CBF3含有1个跨膜螺旋。
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