科研产出
川芎α-淀粉酶抑制剂基因的原核表达与条件优化
《生物学杂志 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：利用实验室前期已获得的α-淀粉酶抑制剂基因(LASI),将其分别连接到不同载体上构建重组原核表达质粒,在原核表达系统中诱导表达LASI重组蛋白,并优化其诱导条件.通过Western Blot分析鉴定LASI重组蛋白,并采用碘-淀粉呈色法测定LASI对猪源淀粉酶的抑制活性.结果表明:pET28a是LASI的较好表达载体,当诱导时间为8 h,IPTG终浓度为1.0 mmol/L,诱导温度为27℃时,LASI重组蛋白的表达量达到最佳;在最优的诱导表达条件下,表达出的部分LASI重组蛋白以可溶性蛋白的形式存在,并能够与HIS标签单抗杂交;经纯化后获得的LASI重组蛋白对猪源淀粉酶存在抑制作用,终抑制比为34%.研究优化LASI重组蛋白的表达条件,获得足量的LASI重组蛋白,为进一步研究LASI的功能奠定基础.
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血橙果肉MYB转录因子的克隆与表达分析
《农业生物技术学报 》 2020 北大核心 CSCD
摘要：花青苷是一种高活性的黄酮多酚类化合物,广泛存在于各种植物中.MYB转录因子调控植物体内花青苷生物合成.本研究从血橙(Citrus sinensis)果肉中克隆了MYB转录因子,并进行生物信息学分析及基因表达研究;同时,构建原核表达载体PET28-CsMYB,所获得重组蛋白经新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus)免疫制备多克隆抗体,进而使用Western blot技术分别检测了不同样本之间MYB的差异表达.研究结果表明,血橙MYB型转录因子的核酸全长表达序列为789 bp,编码262个氨基酸,编码蛋白的1~56位与57~111位氨基酸分别具有MYB保守结构域R2和R3,将其命名为CsMYB(GenBank No.KT757348).将不同植物来源的MYB氨基酸全长序列进行多重比对分析并构建系统进化树,结果表明,CsMYB编码蛋白与已报道的荔枝(Litchi chinensis)花青苷调控蛋白(LcMYB1)聚在同一个进化支上,两个蛋白的氨基酸序列同一性为56.1%.对血橙不同组织进行基因差异表达分析,结果显示,CsMYB在果肉组织中高表达;同时参与花青苷生物合成与运输途径的查尔酮合成酶基因(chalcone synthase,CHS)与谷胱甘肽巯基转移酶基因(glutathione S-transferase,GST)在果肉中也呈现高表达;CsMYB基因表达随着果实发育与成熟而逐渐升高;与低花青苷含量的血橙芽变突变体比较,正常花青苷积累的果肉组织中CsMYB基因表达更高,并且CHS表达变化趋势与CsMYB一致.Western blot结果表明,只在血橙果肉样本中有36 kD的MYB蛋白杂交条带.综上所述,CsMYB可能参与调控血橙果肉花青苷的生物合成,本研究可为血橙果实着色机制研究与遗传育种提供参考依据.
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乌桕Cu/Zn超氧化物歧化酶基因克隆及耐盐性
《四川师范大学学报(自然科学版) 》 2016 北大核心
摘要：利用RT-PCR和RACE技术,成功获得了乌桕Cu/Zn超氧化物歧化酶(SsCu/Zn SOD)的cDNA全长.该序列含有486 bp的完整开放阅读框(Gen Bank登录号为KX169161),编码161个氨基酸残基,推测其相对分子质量为16.304 k Da,等电点为6.57.对应开放阅读框的基因组序列含有7个外显子和6个内含子.同源性及保守结构域分析显示SsCu/Zn SOD和其他物种的Cu/Zn SOD有较高的同源性(67.26%~88.69%),含有一个保守的活性区.构建原核表达载体p ET32-SsCu/Zn SOD在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,诱导出目的蛋白.转化菌的盐胁迫实验显示,其具有抗盐胁迫的功能.
关键词： SsCu/Zn超氧化物歧化酶基因 克隆 原核表达 盐胁迫
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乌桕硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶基因的克隆及表达
《西南农业学报 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶是植物脂肪酸合成代谢的关键酶,直接调节膜脂和贮脂中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例。本研究通过RT-PCR及RACE技术,克隆乌桕硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶(SsSAD)的cDNA全长序列。结果显示,该序列包含1个1191 bp的完整的开放阅读框(GenBank登录号为EF079655),编码396个氨基酸,含33个氨基酸的叶绿体转移肽。其成熟肽含有363个氨基酸,推测其分子量为41.5 kDa,等电点为5.42。同源性分析及同源建模数据显示SsSAD和其它物种的SAD有较高的同源性,含有1个保守结构域。构建原核表达载体pMAL-SsSAD,转入大肠杆菌DH5α,并对诱导表达条件进行优化。
关键词： 乌桕 硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶 克隆 生物信息学分析 原核表达
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拟南芥SAT1蛋白的原核表达及抗体制备
《分子植物育种 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：丝氨酸乙酰转移酶(serine acetyltransferase,SAT)是甲硫氨酸和半胱氨酸合成途径的关键酶,利用该基因提高作物中甲硫氨酸水平具有广阔的应用前景。为了研究拟南芥SAT1(Arabidopsis thaliana SAT1)基因的蛋白表达情况及相关功能,构建了带有His标签的AtSAT1基因原核表达载体p ET-30b(+)-SAT1-His(6)。将其导入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化获得了抗原蛋白SAT1-His(6)。该抗原蛋白经免疫兔子,成功制备了具有较高特异性和灵敏性的SAT1蛋白多克隆抗体。Western blotting表明,该抗体可用来检测转AtSAT1基因的转基因玉米株系中SAT1蛋白的积累量,为后期对该基因开展进一步深入研究具有重要意义。
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甘薯HXK基因的克隆、组织表达及生物信息分析
《四川大学学报(自然科学版) 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：通过RT-PCR技术从甘薯的总RNA中克隆得到了全长的己糖激酶基因,测序结果表明HXK(hexokinase)基因编码区长1491bp,编码496个氨基酸,其翻译的蛋白质分子量为53.4kD,其氨基酸序列与其它已知高等植物HXK基因具有很高的同源性.构建了原核表达载体pET-HXK,经IPTG诱导后可表达获得相对分子量约为71kD的外源融合蛋白,与预测结果一致.并对HXK基因在不同组织中的转录水平进行了数字表达谱和荧光定量分析.
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籼稻姊妹染色单体粘着蛋白OsRad21-i基因的原核表达载体构建与表达
《中山大学学报(自然科学版) 》 2009 北大核心 CSCD
摘要：以杂交水稻汕优63的根组织cDNA为模板,采用引物设计引入酶切位点和RT-PCR方法,扩增出了籼稻姊妹染色单体粘着基因OsRad21-i(AY318757)开放阅读框(ORF),命名为Eqfr,两端分别带有BamHⅠ和SalⅠ限制性位点。然后克隆到pGEM-T载体,将重组克隆载体pGEM-T-Eqfr与表达载体pQE30分别同时进行BamHⅠ和SalⅠ双酶切,连接酶切后的Eqfr和pQE30,并转化DH5α感受态细胞,获得了DH5α[pQE30-Eqfr]重组克隆。再以其重组质粒转化M15[pREP-4]感受态细胞,筛选出M15[pQE30-Eqfr,pREP-4]重组克隆。通过诱导表达,检测到了相对分子质量约为116 000的重组蛋白表达,在诱导后的1~3 h里表达量较高,之后表达量开始下降。用实验证实了理论推测ORF的正确性,所获得的表达蛋白及其表达体系为下一步的蛋白质实验奠定了基础。
关键词： 杂交籼稻 姊妹染色单体粘着蛋白 OsRad21-i 原核表达 载体构建
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葡萄A病毒四川分离物的外壳蛋白基因克隆与原核表达
《园艺学报 》 2008 北大核心 CSCD
摘要：葡萄A病毒(Grapevine virus A,GVA)是葡萄病毒属(Vitivirus)的典型种,在世界葡萄产区广泛分布。采集10株‘藤稔’葡萄成熟枝条,使用6种葡萄病毒ELISA试剂盒检测发现,10个样本中有6个感染4种不同的葡萄病毒。以GVA的ELISA阳性植株为材料进行RT-PCR扩增,首次获得了GVA四川分离物SL10的完整外壳蛋白基因(CP),该基因全长597bp。将其与GenBank收录的15个GVA分离物的CP序列进行比对和构建系统进化树,把不同地理起源的GVA分离物分成两个变异组,其中Ⅰ组包括3个分离物(与Ⅱ组的其他分离物只有75.9%~80.1%的序列同一性);其余的13个分离物组成Ⅱ组(组内分离物具有84.4%~99.5%的序列同一性)。构建了GVACP的原核表达质粒PET-30-GVAcp并转化BL21菌株,经IPTG诱导,目的基因得到了大量表达。
关键词： 葡萄 葡萄A病毒 ELISA RT-PCR 外壳蛋白基因 原核表达
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