科研产出
大型艾美耳球虫重组蛋白GAPDH对兔的免疫保护效果评价
《畜牧兽医学报 》 2023 北大核心 CSCD
摘要：本研究旨在评价大型艾美耳球虫重组蛋白（rEm-GAPDH）对兔的免疫保护效果，为大型艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研制奠定基础。根据转录组数据筛选出Em-GAPDH基因，进行原核表达与蛋白纯化；将50只45日龄无球虫感染幼兔随机分为5组（空白对照组、不免疫攻虫组、Trx-His-S tag攻虫对照组、Quil-A saponin攻虫对照组和rEm-GAPDH免疫组）,分别经颈部皮下注射1 mL PBS、1 mL PBS、1 mL PBS含100μg pET-32a空载蛋白和1 mg Quil-A、1 mL PBS含1 mg Quil-A、1mL 100μg rEm-GAPDH含1 mg Quil-A,首免14 d后同等剂量加强免疫，二免14 d后每只兔经口感染1×10~5个大型艾美耳球虫孢子化卵囊，观察各组兔临床症状，每周固定时间采血和称重，感染14 d后宰杀剖检并测定和统计各组兔的卵囊排出量、相对增重、特异性IgG抗体和细胞因子等。结果成功表达了重组蛋白rEm-GAPDH,大小在59 ku左右，且大部分表达在包涵体。免疫保护试验表明：感染后不免疫攻虫组出现症状，而免疫组症状不明显。rEm-GAPDH免疫组的卵囊减少率达57.16%,相对增重率显著大于不免疫攻虫组（P＜0.05）,ACI值为144.96。特异性IgG抗体水平、细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β）水平均与对照组存在显著差异（P＜0.05）。大型艾美耳球虫重组蛋白rEm-GAPDH可以减少增重损失和卵囊排出，能引发宿主体内的细胞免疫和体液免疫应答，具有一定免疫保护作用，可以作为大型艾美耳球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。
关键词： 兔 大型艾美耳球虫 三磷酸甘油醛脱氢酶 重组蛋白 免疫保护
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斯氏艾美耳球虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白对兔的免疫保护效果评价
《畜牧兽医学报 》 2023 北大核心 CSCD
摘要：旨在评价斯氏艾美耳球虫重组蛋白Es-GAPDH对兔的免疫保护效果，为兔斯氏艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研制奠定基础。利用相对荧光定量PCR分析Es-GAPDH在斯氏艾美耳球虫不同发育时期的转录水平，并对Es-GAPDH进行原核表达与蛋白纯化；然后将42只45日龄无球虫幼兔随机分为5组(空白对照组、不免疫攻虫组、Trx-His-S tag攻虫对照组、Quil-A saponin攻虫对照组和rEs-GAPDH免疫组),分别经颈部皮下注射1 mL PBS、1 mL PBS、1 mL PBS含100μg pET-32a空载蛋白含1 mg Quil-A、1 mL PBS含1 mg Quil-A、1 mL 100μg rEs-GAPDH含1 mg Quil-A,首免14 d后同等剂量加强免疫。二免14 d后除空白对照组外，其余各组实验兔经口感染1×10~4个斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊，攻虫后观察各组临床表现，每周定时采血、称重，感染21 d后剖检观察肝组织病理变化，并测定和统计每组的相对增重、料肉比、肝指数、卵囊排出量、生化指标、特异性IgG抗体以及细胞因子等。结果发现，Es-GAPDH在斯氏艾美耳球虫各个发育阶段均有转录，且转录水平存在差异，在孢子化卵囊阶段转录水平最高。免疫保护试验表明：感染后不免疫攻虫组出现兔肝球虫病典型症状，而rEs-GAPDH免疫组症状不明显。rEs-GAPDH免疫组的卵囊减少率达87.09%,相对增重率显著大于三个攻虫对照组(P<0.05),特异性IgG抗体水平、细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β)水平均与不免疫攻虫组存在显著差异(P<0.05),组织病理切片也显示，免疫组相较不免疫攻虫组肝组织被破坏程度低，虫体数量较少。综上，斯氏艾美耳球虫重组蛋白rEs-GAPDH可减少增重损失和卵囊排出，能引发宿主体内的细胞免疫和体液免疫应答，具有一定免疫保护作用，可作为斯氏艾美耳球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。
关键词： 兔 斯氏艾美耳球虫 三磷酸甘油醛脱氢酶 重组蛋白 免疫保护
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达氏鲟内参基因β-actin、GAPDH和EF1-α的克隆及表达稳定性
《农业生物技术学报 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：达氏鲟(Acipenser dabryanus)是我国一类保护动物,具有重要的生态保护和种质资源价值。q RTPCR等分子生物学技术在达氏鲟的保护和种质资源开发过程发挥着重要作用。qRT-PCR技术中内参基因的选择关系到检测结果的准确性。为筛选达氏鲟合适的内参基因,本实验用同源克隆结合本地Blast法克隆得到达氏鲟3个潜在的内参基因:β肌动蛋白(β-actin)(GenBank No. MH790260)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)(GenBank No. MH790259)、和延伸因子1α(elongation factor 1α, EF1-α)(GenBank No. MH790258);采用软件Mega 5.05、DNAStar 7.1、CPHmodels 3.2和ClustalW 2.1分析3个基因的生物信息;使用qRT-PCR分析3个基因在达氏鲟脑、肝脏、肾脏、胰脏、脾脏、食道、胃、幽门盲囊、十二指肠、瓣肠、直肠、肌肉、鳃和皮肤组织中的Cq值,并使用软件geNorm,NormFinder和BestKeeper分析3个基因在14个组织中的表达稳定性。结果表明,达氏鲟潜在q RT-PCR内参基因β-actin、GAPDH和EF1-α的全长CDS分别为1 125、999和1 383 bp,分别编码375、333和461个氨基酸。生物信息学分析显示,3个基因推导的氨基酸序列和蛋白三维结构与其他物种高度一致。设计的β-actin、GAPDH和EF1-αqRT-PCR引物的扩增效率分别为92.2%、93.0%和92.7%;扩增产物的解链温度(Tm)值分别为84、83.5和85℃。综合geNorm,NormFinder和BestKeeper对3个内参基因14个组织表达稳定性的评价结果表明,3种内参基因的稳定性分别为EF1-α>β-actin>GAPDH,且EF1-α和β-actin可作为达氏鲟qRT-PCR研究的内参基因。本实验获得达氏鲟3个潜在的内参基因β-actin、GAPDH和EF1-α的全长CDS,并证实EF1-α和β-actin适用于达氏鲟qRT-PCR研究,这将为qRT-PCR技术在达氏鲟研究中的应用提供基础资料。
关键词： 达氏鲟 内参基因 β-actin GAPDH EF1-α
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