科研产出
大肠杆菌多酚氧化酶的分子克隆及异源高效表达
《中国饲料 》 2024 北大核心
摘要：菜籽粕、棉籽粕等非粮饲料资源存在的酚类化合物芥子碱、棉酚等抗营养因子，严重影响了其饲喂价值。本课题组筛选出的一株大肠杆菌属芥子碱降解菌SDB2已被证实能通过分泌多酚氧化酶来降解芥子碱和棉酚，本试验旨在运用基因工程技术克隆SDB2多酚氧化酶基因，实现其高效表达，为SDB2多酚氧化酶在饲料工业上的规模化应用奠定基础。从大肠杆菌SDB2中克隆出多酚氧化酶基因，将其与质粒pET28a连接后转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中培养，通过PCR鉴定及质粒酶切验证方法构建重组菌株，同时对重组克隆基因进行生物信息学分析。采用“2×2”交叉试验设计，以温度和诱导剂IPTG浓度两个影响因素诱导SDB2多酚氧化酶基因在重组菌株中高效表达，经SDS-PAGE和WB双重验证后，确立最佳诱导条件，最终纯化出目标酶蛋白。结果表明：（1）成功克隆SDB2多酚氧化酶基因，构建出异源表达重组菌株。（2）克隆出的SDB2重组多酚氧化酶基因含目标核苷酸741个，总编码氨基酸263个（含标签氨基酸20个），氨基酸组成的蛋白相对分子质量为28499.0，理论等电点为6.94，据此预测出SDB2重组多酚氧化酶三维结构模型。（3）确立SDB2多酚氧化酶异源高效表达的最佳诱导条件为温度37℃，IPTG浓度1 mmol，该条件下表达出大量可溶性酶蛋白，有利于工业化生产。本试验条件下，大肠杆菌SDB2多酚氧化酶成功实现了分子克隆及异源高效表达，为我国非粮饲料资源实现高效利用提供了技术参考。
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