Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型VP60蛋白重组腺病毒的构建及鉴定

肖璐; 于吉锋; 罗燕; 谢晶; 叶勇刚; 吴学婧; 毛从剑; 李兴玉; 曹冶; 林毅; 潘梦; 叶健强; 魏勇; 康润敏; 《中国畜牧兽医 》 2023 北大核心 CSCD

摘要：【目的】试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体，构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒，为RHDV2新型疫苗研究提供依据。【方法】修饰、合成带有Kozak序列的VP60基因序列，将其与腺病毒穿梭质粒进行重组，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，构建重组腺病毒穿梭质粒，并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定；采用Ad Max腺病毒包装系统，基于HEK293细胞进行穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的定点同源重组，构建重组腺病毒Ad5-RHDV2-VP60并感染HEK293细胞，通过RT-PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)对重组腺病毒进行表达验证；利用Reed-Muench方法测定重组腺病毒的病毒滴度。【结果】重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见2条大小分别为3 895和1 752 bp的条带，测序比对结果显示，其与GenBank中公布的相应序列相似性>99%,表明穿梭质粒构建成功。RT-PCR结果可见大小约为515 bp的特异性条带；Western blotting结果显示，大小约为60 ku的VP60蛋白特异性条带；IFA观察结果显示，感染重组腺病毒的HEK293细胞产生了绿色荧光，表明重组病毒能在HEK293细胞中表达VP60蛋白，且该蛋白具有良好的抗原性；病毒滴度测定结果显示，初代重组腺病毒的TCID_(50)为10~(5.5)/0.1 mL。【结论】本试验构建了含RHDV2 VP60基因的重组腺病毒，并成功表达了RHDV2 VP60蛋白，为进一步研究开发RHDV2疫苗提供了病毒模型。

关键词： 兔瘟 兔出血症病毒2型(RHDV2) 重组腺病毒 HEK293细胞 Kozak序列