文献类型： 中文期刊

作者： 肖璐 ¹ ; 于吉锋 ¹ ; 罗燕 ² ; 谢晶 ¹ ; 叶勇刚 ¹ ; 吴学婧 ¹ ; 毛从剑 ¹ ; 李兴玉 ¹ ; 曹冶 ¹ ; 林毅 ¹ ; 潘梦 ¹ ; 叶健强 ¹ ; 魏勇 ¹ ; 康润敏 ¹ ;

作者机构： 1.四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室

2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室

关键词： 兔瘟;兔出血症病毒2型(RHDV2);重组腺病毒;HEK293细胞;Kozak序列

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2023 年 08 期

页码： 3336-3344

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体，构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒，为RHDV2新型疫苗研究提供依据。【方法】修饰、合成带有Kozak序列的VP60基因序列，将其与腺病毒穿梭质粒进行重组，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，构建重组腺病毒穿梭质粒，并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定；采用Ad Max腺病毒包装系统，基于HEK293细胞进行穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的定点同源重组，构建重组腺病毒Ad5-RHDV2-VP60并感染HEK293细胞，通过RT-PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)对重组腺病毒进行表达验证；利用Reed-Muench方法测定重组腺病毒的病毒滴度。【结果】重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见2条大小分别为3 895和1 752 bp的条带，测序比对结果显示，其与GenBank中公布的相应序列相似性>99%,表明穿梭质粒构建成功。RT-PCR结果可见大小约为515 bp的特异性条带；Western blotting结果显示，大小约为60 ku的VP60蛋白特异性条带；IFA观察结果显示，感染重组腺病毒的HEK293细胞产生了绿色荧光，表明重组病毒能在HEK293细胞中表达VP60蛋白，且该蛋白具有良好的抗原性；病毒滴度测定结果显示，初代重组腺病毒的TCID_(50)为10~(5.5)/0.1 mL。【结论】本试验构建了含RHDV2 VP60基因的重组腺病毒，并成功表达了RHDV2 VP60蛋白，为进一步研究开发RHDV2疫苗提供了病毒模型。