科研产出
经典RHDV与RHDV2对家兔致病性和组织嗜性的比较研究
《黑龙江畜牧兽医 》 2024 北大核心
摘要：为了比较经典兔出血症病毒（RHDV）与兔出血症病毒2型（RHDV2）对家兔的致病性与组织嗜性差异，试验将15只45～50日龄家兔随机分成3组，分别为经典RHDV攻毒组、RHDV2攻毒组和对照组，每组5只，经典RHDV攻毒组和RHDV2攻毒组每只家兔分别皮下注射含2×108 copies/μL经典RHDV和RHDV2的病毒悬液1 mL,对照组每只家兔皮下注射PBS 1 mL,持续观察并记录每组的精神状态、体重变化、采食情况、运动状况和死亡情况，并于攻毒36 h后处死并剖检各组未死亡家兔。无菌采集各组肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、心脏、脑、胃、肠、蚓突、圆小囊进行石蜡切片制作、H.E.染色和组织病变观察。各组无菌多点位采集等量心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织，提取病毒RNA反转录成cDNA后采用实时荧光定量PCR方法检测各组织中病毒载量。结果表明：攻毒后第6～10小时，经典RHDV攻毒组和RHDV2攻毒组均表现为精神沉郁、厌食、静卧、嗜睡、反应迟钝、体重下降等临床症状。经典RHDV攻毒组于攻毒后第24～25小时死亡3只，死亡率为60%（3/5）;RHDV2攻毒组于攻毒后第8～21小时全部死亡，死亡率达100%（5/5）;对照组5只家兔均存活且无异常表现。剖检可见经典RHDV攻毒组和RHDV2攻毒组气管环状出血，且RHDV2攻毒组气管中出现大量泡沫；经典RHDV攻毒组和RHDV2攻毒组肝脏质脆、肿大、出血，肺脏严重出血，心脏有明显出血点，脾脏明显肿大，经典RHDV攻毒组的组织匀浆中仅检出经典RHDV,RHDV2攻毒组的组织匀浆中仅检出RHDV2。经典RHDV攻毒组和RHDV2攻毒组的组织切片中可见多组织器官变性、坏死、扩张或淤血，其中RHDV2攻毒组肝脏和脾脏的损伤程度大于经典RHDV攻毒组；而蚓突、圆小囊和脑部未见明显病理变化；对照组所有组织器官均未见明显病变与异常。经典RHDV攻毒组内脏病毒载量从高到低依次为肝脏、脾脏、肾脏、肺脏和心脏；RHDV2攻毒组内脏病毒载量从高到低依次为肝脏、脾脏、肺脏、心脏和肾脏。RHDV2攻毒组肝脏、脾脏、肺脏病毒载量高于经典RHDV攻毒组，而心脏、肾脏病毒载量低于经典RHDV攻毒组。说明家兔感染经典RHDV或RHDV2后临床症状相似，相比经典RHDV,RHDV2的致病性更强；肝脏是经典RHDV或RHDV2侵染和定植的主要组织。
关键词： 兔瘟 兔出血症病毒(RHDV) 兔出血症病毒2型(RHDV2) 致病性 组织嗜性
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Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型VP60蛋白重组腺病毒的构建及鉴定
《中国畜牧兽医 》 2023 北大核心 CSCD
摘要：【目的】试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体，构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒，为RHDV2新型疫苗研究提供依据。【方法】修饰、合成带有Kozak序列的VP60基因序列，将其与腺病毒穿梭质粒进行重组，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，构建重组腺病毒穿梭质粒，并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定；采用Ad Max腺病毒包装系统，基于HEK293细胞进行穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的定点同源重组，构建重组腺病毒Ad5-RHDV2-VP60并感染HEK293细胞，通过RT-PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)对重组腺病毒进行表达验证；利用Reed-Muench方法测定重组腺病毒的病毒滴度。【结果】重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见2条大小分别为3 895和1 752 bp的条带，测序比对结果显示，其与GenBank中公布的相应序列相似性>99%,表明穿梭质粒构建成功。RT-PCR结果可见大小约为515 bp的特异性条带；Western blotting结果显示，大小约为60 ku的VP60蛋白特异性条带；IFA观察结果显示，感染重组腺病毒的HEK293细胞产生了绿色荧光，表明重组病毒能在HEK293细胞中表达VP60蛋白，且该蛋白具有良好的抗原性；病毒滴度测定结果显示，初代重组腺病毒的TCID_(50)为10~(5.5)/0.1 mL。【结论】本试验构建了含RHDV2 VP60基因的重组腺病毒，并成功表达了RHDV2 VP60蛋白，为进一步研究开发RHDV2疫苗提供了病毒模型。
关键词： 兔瘟 兔出血症病毒2型(RHDV2) 重组腺病毒 HEK293细胞 Kozak序列
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